復合蛋白酶水解棉粕制備多肽的工藝優化

復合蛋白酶水解棉粕制備多肽的工藝優化

潘進權，鄭玉霞，張耀尹
（嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048）

摘要：為提高棉粕蛋白資源的利用率，考察了復合蛋白酶水解脫酚棉粕制備多肽的工藝。以多肽得率和水解度為評價指標，比較了不同蛋白酶對棉粕蛋白水解能力的差異，確定了以胰蛋白酶與米曲霉蛋白酶按照酶活比3∶ 1構建的復合蛋白酶作為水解棉粕蛋白的最佳蛋白酶。采用單因素試驗及響應面試驗對影響棉粕蛋白水解的因素底物蛋白質量濃度、加酶量、pH、酶解溫度以及酶解時間進行了分析，并確定了棉粕蛋白水解的最佳工藝條件為：棉粕蛋白質量濃度25 g/L，加酶量5 000 U/g，pH 8.91，酶解溫度50~55 ℃，酶解時間5.92 h。在最佳工藝條件下，水解棉粕蛋白的多肽得率可以達到71.85%。多肽的氨基酸分析結果表明，酶水解制備的多肽能基本保持原棉粕蛋白的氨基酸組成，其氨基酸種類較齊全，8種必需氨基酸含量豐富，營養價值較高。
關鍵詞：復合蛋白酶；棉粕；水解；多肽；工藝優化
中圖分類號：TS229;TS201.1    文獻標識碼：A      文章編號：1003-7969（2018）12-0059-06

Optimization of hydrolysis process of cottonseed meal by
composite protease for preparation of polypeptides
PAN Jinquan，ZHENG Yuxia, ZHANG Yaoyin
(School of Life Science and Technology, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, Guangdong, China)

Abstract：To improve the utilization ratio of protein resources from cottonseed meal, the preparation process of polypeptides from the hydrolysis of gossypol removed cottonseed meal by composite protease was investigated. Taking the yield of polypeptides and degree of hydrolysis as the evaluation indexes, the different types of proteases on hydrolysis capability of protein from cottonseed meal were compared, and a composite protease composed with trypsin and Aspergillus oryzae protease in a enzyme activity ratio of 3∶ 1 was determined as the optimal protease for the hydrolysis process. Then, the hydrolysis process conditions, including protein mass concentration of cottonseed meal, enzyme dosage, pH, hydrolysis temperature and hydrolysis time were analyzed and optimized by single factor experiment and response surface methodology. And the optimal process conditions were determined as follows: protein mass concentration of cottonseed meal 25 g/L, enzyme dosage 5 000 U/g, pH 8.91, hydrolysis temperature 50-55 ℃ and hydrolysis time 5.92 h. Under the optimal conditions, the yield of polypeptides was 71.85%. The results of amino acid composition showed that polypeptides could effectively maintain the amino acid composition of cottonseed meal protein, the variety of amino acids was complete, contents of eight kinds of essential amino acids were abundant and the nutritive value was high. 
Key words：composite protease; cottonseed meal; hydrolysis; polypeptides; process optimization



  棉粕是棉籽經過脫殼、去絨，提取油脂后所得的副產品。棉粕中蛋白質含量相當豐富，平均可達40%左右，其氨基酸組成較合理，是一類優質的飼料蛋白[1-2]。多年來，棉粕在我國常被用作飼料中替代魚粉的植物蛋白源[3-4]。然而，由于棉粕中含有棉酚、環丙烯脂肪酸、單寧等抗營養因子，尤其是棉酚，極易引起動物中毒甚至死亡[5-7]。這在很大程度上制約了棉粕的推廣使用。
     近年來，隨著國內棉花種植規模及產量的逐年上升，我國已成為世界最大的產棉國，棉粕每年的產出都在600萬t以上[8]，因此開展棉粕加工及利用對于提高棉花副產物的經濟價值有重要意義。此外，隨著我國養殖業的發展，集約化養殖模式的廣泛推廣，飼料的消費量呈逐年上升趨勢，作為飼料主成分的魚粉、豆粕等蛋白質飼料資源的需求供不應求，甚至嚴重不足[9-10]。因此，開展棉粕蛋白資源的飼料加工已成為當務之急。
     目前，國內外對棉粕的開發研究多集中在微生物發酵法，借助微生物的作用消除棉粕中的抗營養因子及棉酚的毒性，研究主要側重于微生物菌株的篩選[11-12]、發酵工藝的探究[13-15]、發酵棉粕的應用等。但由于棉粕微生物發酵多是采用固態發酵工藝，發酵過程較粗放，自動化程度低，工藝放大也較困難。考慮到棉粕中主要成分是蛋白質，作為魚粉替代也是希望利用其中的蛋白質資源，因此本研究提出了棉粕中蛋白質的酶法水解工藝，借助蛋白酶的水解作用有效地提取棉粕中的蛋白質，并將其轉化為利用效率更高的飼用多肽。研究結果將為棉粕蛋白的加工與利用奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
1.1.1 原料與試劑
     棉粕：購于農貿市場；胰蛋白酶：國藥集團化學試劑有限公司；堿性蛋白酶：南京奧多福尼生物科技有限公司；中性蛋白酶：Novo酶制劑公司；木瓜蛋白酶：北京鼎國生物技術有限責任公司；米曲霉蛋白酶：實驗室自制；其他試劑均為國產分析純。
1.1.2 儀器與設備
     SKD-08S2紅外智能消化爐、SKD-600自動凱氏定氮儀；723N可見光分光光度計；HWS28型電熱恒溫水浴鍋；L550臺式低速大容量離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；PHS-3C數顯pH計；HJ-2A數顯恒溫多頭磁力攪拌器；DFY-200手提式高速中藥粉碎機。
1.2 試驗方法
1.2.1 蛋白酶酶活的測定
     蛋白酶活力測定采用Folin-酚法[16]。
1.2.2 棉粕的脫酚
     棉粕→粉碎→篩分→酸性乙醇混合溶液浸提→離心→沉淀→60 ℃烘箱烘干→脫酚棉粕[17]。
     操作要點：取90 mL濃鹽酸和800 mL無水乙醇，混合后加水定容至1 000 mL，配制得到酸性乙醇混合溶液；按照每克棉粕粉加入25 mL酸性乙醇混合溶液，將棉粕粉與酸性乙醇混合溶液混合并置于60 ℃水浴保溫4 h；將處理后的棉粕粉于4 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀并烘干即得到脫酚棉粕粉。
1.2.3 棉粕的酶解
     脫酚棉粕→加入蒸餾水→調節pH至酶解適宜pH→加入蛋白酶液→保溫酶解→調節pH至4.5→沸水浴滅酶→離心分離→蛋白水解液。
     操作要點：加入蒸餾水配制底物蛋白質量濃度為30 g/L的脫酚棉粕溶液，80 ℃水浴保溫20 min，冷卻后調節其pH至8.0，按照3 000 U/g的加酶量加入蛋白酶液，充分混勻后置于50 ℃水浴中保溫酶解4 h；調節酶解液pH至4.5，在100 ℃水浴中保溫10 min進行滅酶；在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液即得到蛋白水解液。
1.2.4 水解液中蛋白水解度的測定
     采用凱氏定氮法測定原料液中總氮含量；采用甲醛滴定法測定水解液中的氨基態氮含量[18]。
     水解度定義為蛋白質水解中被裂解的肽鍵數占原料蛋白質總肽鍵數的百分數。即水解度=水解液中氨基態氮含量/原料液中總氮含量×100%。
1.2.5 水解液中多肽含量的測定及得率計算
     水解液中多肽含量的測定采用酸溶性蛋白測定方法：取蛋白水解液5 mL，加入濃度2 mol/L的三氯乙酸5 mL，充分混勻后靜置10 min；然后于8 000 r/min離心10 min，收集上清液；采用凱氏定氮法測定上清液中氮含量。水解液中多肽得率按下式計算：
     多肽得率=水解液中肽氮含量/原料液中總氮含量×100%
1.2.6 多肽的氨基酸組成分析
     取蛋白水解液5 mL，加入濃度為2 mol/L的三氯乙酸5 mL，充分混勻后靜置10 min；然后于8 000 r/min離心10 min，收集得到上清液；取一定量上清液經酸水解后利用氨基酸自動分析儀測定樣液中各氨基酸的含量。
1.2.7 蛋白酶的比較及優選
     按照1.2.3所述方法，在其他條件不變的前提下，分別采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、米曲霉蛋白酶進行酶水解試驗并測定蛋白水解液的多肽得率及水解度，比較不同蛋白酶對棉粕蛋白水解效率的差異，篩選出適于棉粕蛋白水解的蛋白酶類型。
1.2.8 蛋白酶的復配
     以胰蛋白酶作為主酶，分別與堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、米曲霉蛋白酶按照1∶ 1（酶活比，下同）組合配制復合蛋白酶液；按照1.2.3所述方法進行酶水解試驗并測定蛋白水解液的多肽得率及水解度，考察不同復合蛋白酶對棉粕蛋白水解效率的差異，由此確定適于棉粕蛋白水解的復合蛋白酶。
1.2.9 蛋白酶復配比例的選擇
     設計胰蛋白酶與米曲霉蛋白酶按照1∶ 4、1∶ 3、1∶ 2、1∶ 1、2∶ 1、3∶ 1、4∶ 1的比例進行復配，以復配后的復合蛋白酶按照1.2.3的方法進行酶水解試驗并測定蛋白水解液的多肽得率及水解度，確定復合蛋白酶的復配比例。
1.2.10 酶水解工藝的單因素試驗
1.2.10.1 底物蛋白質量濃度對蛋白水解的影響
     配制底物蛋白質量濃度分別為10、20、25、30、35、40、50、60 g/L的脫酚棉粕溶液，在其他條件不變條件下，按照1.2.3所述方法進行酶水解試驗并測定蛋白水解液的多肽得率，考察底物蛋白質量濃度對棉粕蛋白水解的影響。
1.2.10.2 加酶量對蛋白水解的影響
     按照1.2.3所述方法，在其他條件不變條件下，在加酶量為分別1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g的條件下，進行酶水解試驗并測定蛋白水解液的多肽得率，考察加酶量對棉粕蛋白水解的影響。
1.2.10.3 pH對蛋白水解的影響
     按照1.2.3所述方法，在其他條件不變條件下，在pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的條件下，進行酶水解試驗并測定蛋白水解液的多肽得率，考察pH對棉粕蛋白水解的影響。
1.2.10.4 酶解溫度對蛋白水解的影響
     按照1.2.3所述方法，在其他條件不變條件下，在酶解溫度分別為35、40、45、50、55、60、65 ℃的條件下，進行酶水解試驗并測定蛋白水解液的多肽得率，考察酶解溫度對棉粕蛋白水解的影響。
1.2.10.5 酶解時間對蛋白水解的影響
     按照1.2.3所述方法，在其他條件不變條件下，在酶解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、40、5.0、6.0、7.0 h的條件下，進行酶水解試驗并測定蛋白水解液的多肽得率，考察酶解時間對棉粕蛋白水解的影響。
1.2.11 酶解工藝的響應面試驗
     在單因素試驗的基礎上，篩選出對棉粕蛋白水解有較顯著影響的3個工藝條件：pH、加酶量、酶解時間，以及各因素的適宜取值范圍。采用響應面分析法中的Box-Behnken試驗設計，對這3個因素做進一步考察，由此確定棉粕蛋白水解的最佳工藝條件。
2 結果與分析
2.1 蛋白酶的比較及優選（見表1）

表1 不同蛋白酶對棉粕蛋白水解效果的比較

由表1可知，胰蛋白酶對棉粕蛋白的水解效果相對最好，初步說明胰蛋白酶的肽鍵選擇性對棉粕蛋白的肽鍵組成及分布有較好的適應性；此外，米曲霉蛋白酶對棉粕蛋白也顯示出較強的水解能力，而且其水解液的水解度明顯高于其他幾種蛋白酶，這與該蛋白酶中所含有的部分外切型蛋白酶酶活有直接關系；在試驗的5種蛋白酶中木瓜蛋白酶對棉粕蛋白的水解效果最差。
2.2 蛋白酶的復配（見表2）

表2 不同復合蛋白酶對棉粕蛋白水解效果的比較

 由表2可知，與胰蛋白酶配伍后，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解效率有了明顯的提升；而胰蛋白酶與米曲霉蛋白酶復配后更是顯示出了協同性，復合酶的水解效果均優于單一蛋白酶。根據試驗結果確定以胰蛋白酶與米曲蛋白酶配伍構建復合蛋白酶。
2.3 蛋白酶復配比例的選擇(見表3)

表3 蛋白酶復配比例對棉粕蛋白水解效果的比較

由表3可知，提高胰蛋白酶在復合蛋白酶中的比例，則可增加多肽的得率；而增加復合蛋白酶中米曲霉蛋白酶的比例，則在一定程度上可增加水解液的水解度。鑒于本研究的目的在于提高多肽得率，因此確定復合蛋白酶中胰蛋白酶與米曲蛋白酶的復配比例為3∶ 1。后續工藝研究均采用此復合蛋白酶。
2.4 酶水解工藝的單因素試驗
2.4.1 底物蛋白質量濃度對蛋白水解的影響（見圖1）

 由圖1可知，多肽得率隨著底物蛋白質量濃度的增加而呈現下降的趨勢，尤其是當底物蛋白質量濃度超過25 g/L以后下降趨勢更顯著。這可能是由于棉粕蛋白經過了熱處理及酸處理后，其變性程度很高而難溶于水，從組織中分散到水溶液的效率較低，影響了酶水解效率；而且，隨著棉粕蛋白質量濃度增加，酶水解體系中小肽濃度隨之增加，小肽對蛋白酶的反饋抑制作用增強，從而導致酶水解體系中有效酶活降低；另外，隨著底物質量濃度的增加，酶水解體系的黏稠度會迅速上升，將導致蛋白質分子運動能力降低，從而降低了蛋白的水解效率。根據以上試驗結果，確定酶水解體系適宜的底物蛋白質量濃度為25 g/L。
2.4.2 加酶量對蛋白水解的影響（見圖2）

由圖2可知，隨加酶量的增加多肽得率呈增長趨勢，說明在設定的酶水解條件下棉粕蛋白的水解程度不斷提高；當加酶量超過5 000 U/g后，多肽得率趨于穩定，說明酶解體系中蛋白酶相對棉粕蛋白已趨于飽和，進一步提升加酶量的意義不大。通過試驗初步確定適宜的加酶量為5 000 U/g。
2.4.3 pH對蛋白水解的影響（見圖3）

由圖3可知，多肽得率對pH變化較為敏感，堿性條件可顯著提高多肽得率，這與胰蛋白酶及米曲霉蛋白酶在偏堿性條件下較強的酶活有直接關系；此外，堿性條件也有利于提高棉粕蛋白的溶出速率，增加棉粕蛋白在水溶液中的溶解度。通過以上試驗可初步確定酶水解體系適宜的pH在9.0左右。
2.4.4 酶解溫度對蛋白水解的影響（見圖4）

由圖4可知，在35～55 ℃范圍內，多肽得率隨著酶解溫度的升高而增加，這說明體系中棉粕蛋白的水解程度逐步上升，由于適當升溫在一定程度上增加了蛋白酶的活力，而且提高了棉粕蛋白的溶出速率；當酶解溫度超過55 ℃，多肽得率隨著酶解溫度的升高迅速下降，這是由于高溫導致了蛋白酶變性失活。根據以上結果，可確定復合蛋白酶水解棉粕蛋白的適宜溫度在50~55 ℃。
2.4.5 酶解時間對蛋白水解的影響（見圖5）

由圖5可知，棉粕蛋白的水解過程可以分為兩個階段：0.5~3 h是快速水解期，在此期間體系的多肽得率迅速上升。這是由于棉粕蛋白向水溶液中擴散溶出的速率較高，復合蛋白酶對底物蛋白上最敏感的肽鍵進行了切割，導致體系中可溶性蛋白及多肽濃度得以迅速增加；3 h以后為緩慢水解期，在這一階段由于體系中底物蛋白濃度較低，棉粕蛋白的溶出速率大幅下降，胰蛋白酶主要作用于大片段肽段上的次級敏感鍵，酶活性相對降低，因此體系的多肽得率表現為緩慢上升并在6 h后逐步趨于穩定。
2.5 酶水解工藝的響應面試驗
     通過單因素試驗，固定酶解溫度50~55 ℃，底物蛋白質量濃度25 g/L，選取pH、加酶量及酶解時間3個因素進行響應面優化試驗。響應面試驗的因素水平見表4，響應面試驗設計與結果見表5。

以多肽得率Y為響應值，對表5中的試驗結果進行回歸分析，可以擬合得到以下數學模型：
     Y=68.04+0.95A+3.21B+1.71C-1.35AB-0.75AC+1.17BC-4.26A2-0.53B2-3.23C2
     對表5的試驗結果及回歸模型進行方差分析，結果如表6所示。由表6可知，因素B和因素C對試驗結果有極顯著影響（P＜0.01）；因素A對試驗結果有顯著影響（P＜0.05）；此外，因素A、B間以及因素B、C間均表現出顯著的交互作用（P＜005）。對模型分析的結果表明，以上擬合得到的模型具有極高的顯著性（P<0.000 1），失擬項不顯著（P=0244 5>0.05）；模型的相關系數R2=0980 3，顯示該模型對試驗結果有非常高的擬合度，運用此模型可以對各因素取值范圍內98.03%的試驗結果進行有效的數學預測。

表6 響應面試驗結果的方差分析

通過Design Expert 10.0軟件分析可確定出相應曲面上的最大響應值為Y=71.40%，與之對應的各因素取值分別為：pH（A）8.91，加酶量（B）5 000 U/g，酶解時間（C）5.92 h。
     根據以上的單因素試驗及響應面試驗結果確定棉粕蛋白的最佳酶水解工藝條件為：采用胰蛋白酶與米曲霉按3∶ 1構成的復合蛋白酶，加酶量5 000 U/g，底物蛋白質量濃度25 g/L，pH 8.91，酶解溫度50~55 ℃，酶解時間5.92 h。在最佳酶水解工藝條件下進行了驗證性試驗，經過5次獨立酶水解試驗，其結果（70.84%、72.28%、72.49%、71.64%和7202%）的平均值為71.85%，與模型預測值相吻合，進一步驗證了該模型的可靠性。且該結果顯著高于微生物法的多肽轉化率[11,14]。
2.6 多肽的氨基酸組成分析
     用三氯乙酸沉淀法對蛋白水解液進行脫蛋白處理后分離得到酸溶性肽，運用氨基酸自動分析儀對水解液中酸溶性肽的氨基酸組成進行了分析，結果如表7所示。由表7可看出，棉粕蛋白具有較好的營養價值，含有動物體所需的17種氨基酸（因檢測條件限制沒能檢測色氨酸），人體所需的必需氨基酸含量豐富；經復合蛋白酶水解棉粕蛋白制備得到的酸溶性多肽混合物能較好地保持原棉粕蛋白的氨基酸組成，大多數氨基酸的百分含量保持不變。

表7 酸溶性肽氨基酸組成

3 結 論
     本研究以提高棉粕蛋白的利用率為目標，探討復合蛋白酶水解棉粕蛋白制備多肽的工藝路線。比較了不同蛋白酶對棉粕蛋白水解效果的差異。結果表明：胰蛋白酶對棉粕蛋白具有較好的適應性，其水解效率較高，而木瓜蛋白酶對棉粕蛋白的水解效果最差；胰蛋白酶與米曲霉蛋白酶之間有較好的協同性，兩者按照酶活比3∶ 1構建的復合蛋白酶對棉粕蛋白有最強的水解能力。采用單因素試驗及響應面試驗對復合蛋白酶水解棉粕蛋白的工藝條件進行了優化，確定最佳的酶水解工藝條件為：加酶量5 000 U/g，底物蛋白質量濃度25 g/L，pH 8.91，酶解溫度50～55 ℃，酶解時間5.92 h。在最佳酶水解工藝條件下，多肽得率可以達到71.85%。對水解液中酸溶性多肽的氨基酸組成進行了分析，結果顯示：酶水解得到的多肽能基本保持原棉粕蛋白的氨基酸組成，多肽的氨基酸種類較齊全，8種必需氨基酸含量豐富，營養價值高。以上結果表明，采用復合蛋白酶水解棉粕蛋白制備多肽的工藝具有較好的可行性。
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